Для атомной спектроскопии надо разрушить вещество на отдельные атомы, а для молекулярной нельзя, поэтому обычно исследуют спектры поглощения в УФ, видимом и ИК-диапазонах при обычных температурах. Атомы и молекулы подчиняются законам квантовой механики. Они могут находиться в состояниях с различными энергиями за счёт переходов электронов на более высокие уровни, а для молекул также за счёт колебаний и вращений. Энергетические уровни каждого вида движений дискретны и характеризуются квантовыми числами. Энергия двухатомнеой молекулы состоит из электронной, колебательной и вращательной,

Е = Е эл + Е кол + Е вр.

Е эл >> E колеб >> Е вращ

На рисунке пример энергетических уровней двухатомной молекулы. Показаны два электронных сосояния - основное и первое возбуждённое. Каждое состояние имеет подуровани за счёт колебательных состояний, в те свори подуровни за счёт вращательных.Уровней много по сравнению с атомами, между ними возможно много переходов, близких по частотам, они сливаются друг с другом и вместо линий наблюдаются полосы. Атомные спектры линейные, молекулярные - полосатые.

Молекулярные спектры исследуются с помощью двух типов спектрометров – УФ (объединённого с видимым) и ИК.

Уф и видимая спектроскопия

Исследуются электронные спектры поглощения, связанные с переходом электронов на более высокие энергетические уровни. Наблюдаются спектры органических молекул, содержащие двойные или тройные связи, либо атомы с неподелёнными электронными парами (поглощающие группы называются хромофорами). Пример в таблице, где приведены длины волн, соответствующие максимуму полосы УФ-спектра.

Хромофор

молекула

 max (ммк)

C 2 H 5 CH=C=CH 2

Обнаружение в спектрах таких полос обнаруживает входящие в молекулу группы, что важно для качественного анализа. Количественный анализ основан на измерении коэффициента поглощения света исследуемым раствором на определённых частотах.

УФ-спектрофотометр состоит из источника излучения, призмы, щели и фотоэлемента. Источник -водородная лампа, то-есть дуга постоянного тока в атмосфере водорода при низком давлении, дающая сплошное излучение в широкой области частот. Свет проходит через призму и затем через щель, которая выделяет узкую область длин волн (частот). Далее свет проходит через кювету - сосуд с плоскопараллельными прозрачными стенками, заполненный исследуемым раствором и попадает на фотоэлемент. Коэффициент поглощения света - отношение интенсивностей падающего на образец и прошедшего через него лучей света от источника. Для того, чтобы сделать поправку на поглощение света растворителем, используют эталонный образец с чистым растворителем. Светопоглощение измеряют по двух- или однолучевой схеме. В первом случае световой поток источника делят на 2 потока равной интенсивности и один пропускают через исследуемый раствор, другой - через эталонный, затем сравнивают интенсивности потоков на выходе. При однолучевой схеме оба раствора устанавливаются по очереди.

Этот же прибор используют для записи спектров в видимой области, в качестве источника применяют лампу накаливания.

Для всех методов молекулярной спектроскопии справедлив закон Бугера- Ламберта-Бэра:

I=I 0 exp(-lc)

ln(I 0 /I)=lc

где молярный коэффициент поглощения (л/моль см), с - концентрация, l - толщина кюветы, I 0 - интенсивность падающего потока, I - интенсивность выходящего потока; отношение I 0 /I называется пропусканием, а log(I o /I) называется оптической плотностью, Если в растворе присутствуют несколько поглощающих веществ, то оптическая плотность раствора равна сумме вкладов каждого из компонентов.

Закон Бугера-Ламберта-Бэра строго выполняется для монохроматического излучения,

Иногда для измерений применяют фотоколориметры, в которых используется ограниченный набор сменных широкополосных стеклянных светофильтров; эти приборы не являются спектральными приборами.

Спектрофотометрия в УФ и видимом диапазонах широко применяется в анализе веществ; в частности, для определения окрашенных соединений ряда металлов, а также As, P, для определения некоторых функциональных групп органических соединений, например фенолов и соединений с кратными химическими связями.

Для увеличения селективности определения применяют фотометрические реагенты, селективно взаимодействующие с определяемым веществом с образованием окрашенного продукта. Например, при определении Fe, Mo, W, Nb, Co и др. применяют тиоцианаты, а при определении меди - аммиак. В качестве фотометрических реагентов, образующих окрашенные комплексы с катионами металлов, широко применяют органические красители. Используется также предварительное разделение компонентов.

Преимущества этой спектрофотометрии - относительная простота аппаратуры, большой опыт применения. Недостаток - невысокая селективность.

Минимальная концентрация, определяемая спектрофотометрическим методом, не ниже 10 -7 М, то-есть чувствительность методов средняя.

Два других вида спектроскопии, часто применяемые в органической химии, - ультрафиолетовая (УФ) спектроскопия и масс-спектрометрия (МС). В этой книге мы не будем подробно на них останавливаться и не будем заниматься интерпретацией спектров, а ограничимся лишь знакомством с основными принципами и характером информации, которую дают эти типы спектроскопии.

Ультрафиолетовая (УФ) спектроскопия изучает поглощение органическими веществами света в ультрафиолетовой области спектра (длина волны от 200 до 400 нм). Излучение с такой длиной волны поглощают только соединения, содержащие -связи (например, группы или Поглощение вызвано электронными переходами внутри молекулы. Для молекул, имеющих -связи, энергетическая разница между основным и возбужденным электронными состояниями соответствует энергии фотонов УФ-излучения. УФ-Излучение вызывает переход электронов на более высокую по энергии молекулярную орбиталь. При этом световая энергия переходит в энергию молекулы.

УФ-Спектр обычно состоит из одной широкой полосы поглощения, положение которой указывает на окружение двойной связи в молекуле. Чем большее число двойных связей в молекуле образует цепь сопряжения, тем больше длина волны поглощаемого света. Термин сопряжение означает, что две двойные связи разделены одной простой связью. В табл. 114 показано положение максимумов поглощения некоторых типичных структур. На рис. 11-22 изображен УФ-спектр -циклогексадиена.

Из табл. 11-4 видно, что появление в цепи сопряжения новой двойной связи увеличивает длину волны поглощаемого УФ-излучения примерно

Рис. 11-22. Уф-Спектр 1,3-циклогексадиена

Таблица 11-4. (см. скан) Положение максимумов поглощения УФ-излучения для некоторых соединений

на 30-50 нм. Обратите также внимание, что вещества, не имеющие двойных связей, не поглощают УФ-излучения.

Если в молекуле имеется цепь сопряжения, состоящая из семи или более двойных связей, то такое вещество поглощает видимый свет (длина волны 400-700 нм) и является окрашенным благодаря избирательному поглощению некоторых цветов.

Ультрафиолетовая спектроскопия позволяет определять число сопряженных углерод-углеродных и углерод-кислородных двойных связей в молекуле. Поглощение возникает вследствие электронных переходов.


Фотометрические (абсорбционные) методы анализа основа-ны на способности анализируемого вещества избирательно по-глощать свет.

Анализ веществ, основанный на измерении светопоглощё-ния, включает спектрофотометрию и фотоколориметрию.

Спектрофотометрия основана на поглощении монохромати-ческого света, т. е. света определенной длины волны (1-2 нм) в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра.

Такого рода измерения поглощения света осуществляются при помощи спектрофотометров различных марок, в которых используется всегда монохроматический поток световой энер-гии, получаемый посредством оптической системы, называемой монохроматором.

Поглощение в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях спектра связано в основном с возбуждением электронов.

Поглощение света в инфракрасной области спектра (ИК) обусловлено молекулярными колебаниями.

В зависимости от диапазона длин волн, при которых измеряют светопо-глощение растворов химических ве-ществ, методы, основанные на измере-нии светопоглощения, подразделяются на спектрофотометрию в УФ-области спектра с диапазоном длин волн 200- 400 нм, спектрофотометрию в види-мой области спектра (400-760 нм) и спектрофотометрию в инфракрасной области спектра (760-20 000 нм). Но обычно единицей измерения длин волн ИК-спектров является микрон (1 мк= = 10 -4 см) или волновое число (см -1), т. е, число волн в 1 см.

В фармацевтическом анализе чаще используется спектроско-пия в УФ- и видимой области спектра.

Метод УФ-спектроскопии включен в ГФ IX, ГФ X и МФ II, а также в последние издания фармакопеи почти всех стран для определения подлинности, чистоты и количественного опреде-ления вещества в препаратах.

Абсорбционный спектр или спектр поглощения представляет собой графическое изображение количества света, поглощенно-го веществом при определенных значениях длин волн.

Для построения характеристической кривой поглощения - величины длин волн (Я,) при УФ-спектроскопии или волновые числа (см -1) при ИК-спектроскопии - наносят на ось абсцисс, а величину погашения (Л) 1 или проценты пропускания (Г) (при ИК-спектроскопии) - на ось ординат (рис. 5, 6).

При построении кривых спектров погашения в УФ- и види-мой части спектров можно использовать величины удельных показателей погашения (Ј 1% i CM) или молярного показателя поглощения (е) 2 , где е - оптическая плотность 1 М раствора ве-щества при толщине слоя в 1 см; Ј 1% i CM - величина погашения раствора, содержащего 1 г вещества в 100 мл раствора при тол-щине слоя в 1 см.

Эти величины определяются экспериментально, для многих веществ они приведены в литературе.

Характеристикой спектра поглощения является положение максимумов (минимумов) поглощения света веществом, а так-же интенсивность поглощения, что характеризуется оптической плотностью (D ) или удельным показателем поглощения (Ј 1% 1см) при определенных длинах волн.

УФ-спектрофотометрическое измерение проводят обычно в растворах. В качестве растворителей используется дистиллиро-

ванная вода, кислоты, щелочи, спирты (этиловый, метиловый) и некоторые другие органические растворители.

Растворитель не должен поглощать свет в той области спектра, что и исследуемое вещество. Характер спектра может изменяться в различных растворителях, а также при изменении рН среды.

Факторами, обусловливающими поглощение света исследуе-мыми веществами, является наличие в их молекулах так назы-

Каждая функциональная группа в молекуле вещества ха-рактеризуется поглощением света в определенной области спектра, что и используется для целей идентификации и коли-чественного определения вещества в препарате.

Кроме хромофоров, в состав молекулы могут входить функ-циональные группы, которые сами по себе не поглощают в близ-ком ультрафиолете, но могут влиять на поведение сопряжен-ного с ними хромофора. Такие группы, называемые ауксохро-мами, обычно вызывают появление поглощения при больших длинах волн и с большим значением коэффициента погашения, чем это свойственно данному хромофору. Примеры ауксохро-мов: -SH, -NH 2 , -ОН.

ИК-спектры для большинства органических соединений, в отличие от УФ-спектров, характеризуются наличием большего числа пиков поглощения (см. рис. 6). Поэтому метод ПК-спект-роскопии дает возможность получить наиболее полную инфор-мацию о строении и составе анализируемого вещества, позво-ляющую идентифицировать очень близкие по структуре соеди-нения.

В ГФ X и МФ II метод ИК-спектроскопии принят для иден-тификации многих органических лекарственных веществ с по-лифункциональными группами в их молекулах путем сравнения со спектрами стандартных образцов, снятых в одинаковых ус-ловиях. В оригинальной литературе последних лет приведены! ИК-спектры антибиотиков, гормонов, кумаринов и многих дру-гих Лекарственных веществ органической природы. В связи с-возрастающими требованиями к качеству лекарств ИК-спектро-скопия как один из надежных методов идентификации приобре-тает все большее значение.

Методы анализа антибиотиков

Активность устанавливают

Единица действия (ЕД)

Сердечные гликозиды

Витамины



Под сроком годности



Окисление

30. Рефрактометрия

Рефрактометрия

Альдегидная группа

1. + фенилгидразина гидрохлорид в виде солянокислого раствора – образование желтого хлопьевидного остатка фенилгидразона.

2. образование основания Шиффа при взаимодействии с ароматическими аминами.

На третичный атом азота

1. с осадительными (общеалкалоидными) реактивами : Вагнера, Майера, Драгендорфа, раствором пикриновой кислоты, а также с раствором дихромата калия.

На атом фосфора

1. Фосфат-ионы образуют с раствором молибдата аммония желтый осадок фосфор-молибдата.

Количественное определние

Фенольный гидроксил

1. + хлорид железа (III). Растворы (водные, спиртовые или ацетоновые) приобретают зеленое окрашивание.

2. Азосочетание.

3. Обр-ие ауринового красителя

Нитрогруппа

1. После гидрирования нитрогруппы в молекуле нитроксолина до ароматической аминогруппы, выполняют реакцию диазотирования и азосочетания со щелочным раствором β-нафтола. Появляется красно-оранжевое окрашивание.

2. + дифениламин в присутствии концентрированной серной кислоты (синее окрашивание).

3. + гидроксид натрия – образуется ацисоли (красно-оранжевое окрашивание).

Третичный атом азота

1. при нагревании в растворе лимонной кислоты и уксусном ангидриде, то появляется пурпурно-красное окрашивание.

2. с осадительными (общеалкалоидными) реактивами : Вагнера, Майера, Драгендорфа, раствором пикриновой кислоты, а также с раствором дихромата калия (желтый осадок).

Нитроксалин образует окрашенные внутрикомплексные соединения с катионами металлов: магния, кадмия, меди (II), цинка, алюминия.

Количественное определние

Нитроксолин определяют методом неводного титрования, используя в качестве растворителя уксусный ангидрид и титранта - 0,1 М раствор хлорной кислоты. Определение нитроксолина выполняют в присутствии муравьиной кислоты и индикатора малахитового зеленого, а определение хлорхинальдола проводят с индикатором кристаллическим фиолетовым.

Сложноэфирная группа

1. гидроксамовая проба

2. + гидроксид натрия

Фенольный гидроксил

1. + хлорид железа (III) и a,a-дипиридил в смеси этанола и бензола. Появляется красное окрашивание.

2. реакции окисления, сопровождающиеся образованием окрашенных веществ.

1 – при нагревании до 80 C с концентрированной азотной кислотой происходит образование окрашенного в красно-оранжевый цвет.

2 – при добавлении гексацианоферрата (III) калия в щелочной среде образуется окрашенный продукт.

3 – соли церия (IV), железа (III), происходит окисление токоферола до о-, n -токоферилхинона, образование которого обусловливает желтое окрашивание.

Эту химическую реакцию используют для количественного определения токоферола ацетата. Определение основано на кислотном гидролизе (кипячением с обратным холодильником в присутствии серной кислоты). Затем выделившийся токоферол титруют сульфатом церия (IV) (индикатор дифениламин) до появления сине-фиолетового окрашивания.

Производные птеридина

Птеридин - гетероциклическая система, состоящая из двух конденсированных гетероциклов пиримидина и пиразина:

К этой группе относится: Фолиевая кислота.

Кислоту фолиевую хранят в хорошо укупоренной таре, в сухом, темном месте, так как она гигроскопична и разлагается под действием света. Особенно быстро процесс разложения происходит в кислой среде в растворах под воздействием ультрафиолетового излучения.

Требования к условиям хранения различных групп ЛВ находятся в зависимости от их физико-химических свойств и воздействия различных факторов внеш­ней среды. Они регламентируют­ся «Инструкцией по организации хранения в аптечных учреждениях различных групп лекарственных средств и изделий медицинского назначения», утвержденной приказом МЗ РФ №377 от 13 ноября 1996 г.

Метод осаждения

Навеску анализируемого вещества растворяют в воде или другом растворителе и осаждают определяемый элемент реактивом в виде малорастворимого соединения. Полученный осадок отфильтровывают, промывают, высушивают, прокаливают и взвешивают. Зная массу осадка, вычисляют содержание определяемого элемента в массовых долях или процентах от взятой навески.

Осажденной формой называют соединение, в виде которого определяемый компонент осаждается из раствора.

Гравиметрической (весовой) формой называют соединение, которое взве­шивают.

Метод выделения

Основан на выделении определяемого компонента из анализируемого вещества и его точном взвешивании.

Метод отгонки

В этом методе определяемый компонент выделяют в виде летучего соединения действием кислоты или высокой температуры.

· Прямая отгонка (определяемый компонент выделяют из пробы в виде газообразного продукта, улавливают и затем определяют его мас­су).

· Косвенная отгонка (массу газообразного продукта определяют по разности масс анализируемого компонента до и после термической обработ­ки).

В практике фармацевтического анализа этот метод широко применяется при определении влажности лекарственных препаратов, растительного сырья.

Методы анализа антибиотиков

Активность устанавливают диффузионным или турбидиметрическим методами . ГФ XI рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, заключающийся в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образца антибиотика на тест-микроорганизм.

Поскольку состав агаровой среды и условия выполнения биологиче­ского испытания одинаковы, величина зоны диффузии (в которой развитие тест-микроорганизма подавляется антибиотиком) зависит только от химической природы антибиотика и его концентрации.

Единица действия (ЕД) представляет собой меру, кото­рой выражается биологическая активность антибиотиков. За ЕД при­нимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды.

К ускоренным микробиологическим методам относят методы, осно­ванные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тест-микроорганизмов (уреазный метод).

Сердечные гликозиды - безазотистые соединения растительного происхождения, характеризующиеся кардиотоническим действием. Данные препараты играют исключительно важную роль в терапии больных с острой и хронической сердечной недостаточностью любого генеза. При определении активности лекарственного сырья и многих препаратов сердечных гликозидов используют биологическую стандартизацию. Наиболее часто активность сердечных гликозидов выражают в лягушачьих единицах действия (ЛЕД) и кошачьих единицах действия (КЕД). Одна ЛЕД соответствует минимальной дозе стандартного препарата, в которой он вызывает остановку сердца у большинства подопытных лягушек, кошек, голубей. Так, размельченный порошок листьев наперстянки по активности соответствует такой пропорции: один грамм порошка листьев равен 50-66 ЛЕД или 10-13 КЕД. В процессе хранения активность листьев уменьшается.

Витамины представляют собой группу веществ различной химиче­ской структуры, необходимых в малых количествах для нормальной жизнедеятельности организма. Ряд витаминов входят в состав фер­ментных систем и являются своеобразными биологическими катализа­торами химических или фотохимических процессов, происходящих в живой клетке (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, пантотеновая кисло­та и др.).

Для качественной и количественной оценки витаминов в природ­ных источниках используют как биологические, так и физико-химиче­ские методы. Принцип оценки биологической активности заключается в том, что животных (крыс, голубей, морских свинок) переводят на диету, содер­жащую белки, жиры, углеводы, минеральные соли и все витамины, кроме исследуемого. Затем устанавливают, какое количество испытуемого витамина может излечить или предохранить животное от авита­миноза. Параллельно проводят аналогичное испытание со стандартным препаратом.

Биологический метод оценки активности витаминов очень трудо­емок, точность его сравнительно невелика. Поэтому для испытания подлинности и количественного определения витаминов обычно ис­пользуют физические, химические и физико-химические методы.

28. Стабильность и сроки годности ЛС (влияние влаги, CO 2 , света, кислорода воздуха, примесей).

Под сроком годности лекарственных средств понимают период времени, в течение которого они должны полностью сохранять свою терапевтическую активность, безвредность и по уровню качественных и количественных характеристик соответствовать требованиям ГФ или ФС (ФСП), в соответствии с которыми были выпущены и хранились в условиях, предусмотренных указанными статьями.

По истечении срока годности ЛС не может быть использовано без переконтроля качества и соответствующего изменения установлен­ного срока годности. Существует определенная взаимосвязь между понятием «срок годности», имеющим временной смысл, и понятием «стабильность», обусловливающим качество ЛС (его устойчивость).

Температура – с увеличением увеличивается скорость реакции; с понижением (понижается активность MgSO 4 , CaCl 2 , раствора адреналина).

Свет – повышается скорость разложения; кристаллические сухие вещества более устойчивы, чем растворы; изменение цвета при длительном освещении; некоторые вещества сохраняют свою активность (содержащие железо, при этом повышается их стабильность).

Влага – снижает фармакологическую активность; + и – влияет на ЛВ; гигроскопичность.

Окисление - процесс, являющийся одной из причин разложения ЛВ. Некоторые из них (производные фенолов) окисляются, находясь в кристаллическом состоянии. Процесс окисле­ния заметно активизируется при растворении. Особенно легко окисляются ЛВ, проявляющие активные восстановитель­ные свойства (альдегиды, гидразиды, производные фенотиазина и др.).

Система мер, направленных на предохранение ЛВ от окисления, сводится прежде всего к уменьшению влияния атмосферного кислорода или максимальному удалению примесей, катализирующих процесс окисления. Используя окислители, можно смоделировать процесс окисле­ния. Если затем сравнить полученные продукты окисления стандарт­ного образца и продукты разложения ЛВ, то можно сделать заключение о механизме процесса окисления. Это позволяет решать вопрос о путях стабилизации, так как станут известны факторы, вли­яющие на скорость реакции окисления.

Методы повышения стабильности:

1) физические (твердые вещества – в плотно укупоренной таре; суспензии – в сухом состоянии; инъекции – в ампулах запечатанных);

2) химические (окисление, металлы).

29. Фармакокинетика и биодоступность.

Фармакокинетика – раздел фармакологии о всасывании, распределении, депонировании, метаболизме и выделении ЛВ.

Проведение фармакокинетических исследований возможно только на основе применения современных методов биофармацевтического анализа, позволяющих проследить процесс всасывания и распределения ЛВ в орга­нах и тканях. Они включают выяснение влияния различных биофар­мацевтических факторов на терапевтическую эффективность ЛВ; изучение их биологической доступности и разработку методов ее определения; создание способов определения ЛВ и их метаболитов в биологических жидкостях.

На фармакокинетику ЛВ оказывают влияние различные факторы: воз­растные, генетические, половые, масса тела, питание, беременность, а также различные патологические процессы, например заболевания печени, почек, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, эндокринные, инфекционные и другие заболевания.

Биодоступность – количество неизменного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата.

Одним из основных этапов любого исследования биологической доступности ЛС является использование биофар­мацевтического анализа для определения концентрации ЛВ (метаболита) в биологических жидкостях.

30. Рефрактометрия

Рефрактометрия основана на наличии зависимости величины показателя преломления света от концентрации раствора испытуемого вещества. Показатель преломления зависит также от температуры, длины волны света, концентрации вещества и природы растворителя. Рефрактометрию используют для установления подлинности лекарственных веществ по молярной рефракции. Для количественного определения выбирают интервал линейной зависимости между концентрацией раствора и коэффициентом преломления. В этом интервале концентрацию (х) вычисляют по формуле: х=(n – n O)/F, где n - показатель преломления раствора вещества; n O - показатель преломления растворителя; F - фактор, равный величине прироста показателя преломления при увеличении концентрации вещества на 1% (устанавливается экспериментально).

Рефрактометрические определения выполняют на рефрактометрах, при стабильной температуре (20±0,3 О C) и длине волны линии D спектра натрия (589,3 нм) в диапозоне показателей преломления от 1,3 до 1,7. Прибор юстируют по эталонным жидкостям или воде очищенной, для которой n D 20 = 1,3330.

Спектрофотометрия в УФ-, видимой, ИК-областях спектра в оценке качества ЛС.

Используют спектрофотометрические методы анализа по поглощению веществами монохроматического электромагнитного излучения.

Фотометрические методы анализа основаны на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера:

В случае несоответствия закону вначале с помощью стандартного раствора устанавливают зависимость оптической плотности от концентрации, а затем строят калибровочный график, с помощью которого выполняют расчеты.

Диапазоны света:

Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях – 1 из широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе.

Анализируемые ЛВ должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обусловливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электромагнитного излучения.

Кривая зависимости интенсивности светопоглощения от длины волны (нм) называется спектром поглощения вещества и является его специфической характеристикой. Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ в УФ (190-380 нм) и видимой (380-780 нм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щело­чей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.

Удельный показатель поглощения представляет собой величину оптической плотности раствора, содержащего 1,0 г вещества в 100 мл раствора, измеренную в кювете с рабочей длиной 1 см. Установив по стандартному образцу величину E и преобразовав эту формулу, можно рассчитать концентрацию анализируемого вещества с относительной погрешностью до ±2%.

Константа измеряется в различных единицах; в молях – молярный коэффициент поглощения, в % - удельный показатель поглощения

Идентификацию ЛВ можно провести по, Е, характеру спектральных кривых в различных растворителях, положению максимума и минимума светопоглощения или их отношению (при различных длинах волн). Для количественного спектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения. Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентов смеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемого вещества.

Спектрофотометрия в ИК-области. Природа полос поглощения в ИК области связана с колебательными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества. Поэтому поглощением в ИК-области обладают молекулы, дипольные моменты которых изменяются при возбуждении колебательных движений ядер. Область применения ИК-спектроскопии аналогична, но более широка, чем у УФ-метода. ИК-спектр однозначно ха­рактеризует всю структуру молекулы, включая незначительные ее изменения. Важные преимущества ИК-спектроскопии - высокая специфичность, объективность полученных результатов, возможность анализа веществ в кристаллическом состо­янии. Для измерения ИК-спектров на однолучевых или двулучевых ИК-спектрофотометрах используют взвеси веществ в вазелиновом масле или помещают анализируемое вещество между пластинами из бромида калия.

Каждый ИК-спектр представляет собой серию полос поглощения, максимумы которых определяются волновым числом, измеряемым в см -1 , и определенной интенсивностью. Для анализа ЛB обычно используют спектральную область от 4000 до 400 см -1 .

ГФ XI рекомендует два способа установления подлинности по ИК-спектрам. Один из них основан на сравнении заре­гистрированных в идентичных условиях ИК-спектров испытуемого ЛB и его стандартного образца. Второй способ заклю­чается в сравнении ИК-спектра испытуемого ЛB с его стандартным спектром, прилагаемым к ФС и зарегистрированным в соответствии с указанными в ней требованиями.

Приборы для фиксации оптических спектров построены по единому принципу. В качестве источника УФ излучения обычно применяется "водородная лампа" (электрический разряд в атмосфере водорода при низком давлении), которая дает практически непрерывный спектр излучения в области 190-360 нм.

Для работы в видимой области служит лампа накаливания с вольфрамовой спиралью. Излучение от источника попадает в монохроматор, состоящий из зеркала, кварцевой призмы и щели. Отражаясь от зеркала, свет разлагается призмой или дифракционные решетки и затем с помощью щели из спектра выделяется узкая область. При вращении призмы спектр перемещается по отношению к щели, что позволяет получать лучи света со строго определенной длиной волны, обычно с точностью ±0,5 нм. Монохроматическое излучение пропускается через кварцевую кювету, содержащую раствор исследуемого вещества в прозрачном для УФ- области растворителе. Толщина кювет 1-10 см, наиболее распространенные кюветы имеют сечение 1´1 см, и для их заполнения требуется около 3 мл раствора. Интенсивность прошедшего через кювету света измеряется с помощью фотоэлемента, величина тока которого пропорциональна интенсивности падающего света. Ток усиливается и регистрируется потенциометром.

Сравнивается интенсивность светового луча, прошедшего через исследуемый раствор, и луча, пропущенного через аналогичную кювету с чистым растворителем. Получаемая разность соответствует поглощению растворенного исследуемого вещества.

Такое сравнение может быть проведено двумя путями. При наличии одного светового луча на его пути попеременно ставят кювету с исследуемым раствором и с растворителем (кювету сравнения). Спектр строят по точкам, постепенно вручную настраивая прибор на определенные длины волн. В современных регистрирующих приборах световой поток делится на два одинаковых пучка, один из которых проходит через исследуемый раствор, а другой - через растворитель, причем как сравнение интенсивностей прошедших через кюветы световых потоков, так и непрерывное изменение длин волн производится автоматически. В том и другом случае получают спектр вещества, представляющий собой зависимость оптической плотности раствора (D) от длины волны поглощаемого света:



В точках максимумов молярный коэффициент погашения вычисляют по формуле

Спектр в большинстве случаев представляет собой кривую с одним пологим максимумом. Большая ширина полосы поглощения обусловлена тем, что помимо основных уровней электронных переходов существуют подуровни, связанные с колебаниями молекулы. Многочисленность таких подуровней обычно приводит к тому, что соответствующие им отдельные максимумы сливаются в один, имеющий пологую форму. В отдельных случаях, например для ароматических соединений, за счет колебательных подуровней максимум поглощения представляет собой набор узких полос по обе стороны от основной. В таких случаях принято говорить, что максимум имеет тонкую структуру.

Приборы различных схем позволяют получать спектры в различных областях спектра. В УФ области поглощают все органические вещества. Длины волн менее 190 нм (дальняя, или вакуумная область УФ спектра) малопригодны для работы, так как в этой области поглощают компоненты воздуха - кислород и азот. Приборы для исследований в интервале длин волн 120-190 нм с вакуумными камерами существуют, однако они сложны и редко используются в обычной лабораторной практике; существуют схемы, где влияние газов воздуха ликвидируют продувкой полостей, по которым проходит луч непоглощающим газом.

Для волн длиной более 200 нм воздух прозрачен, что делает ближнюю ультрафиолетовую и видимую области спектра (190-800 нм) удобными для измерений. В том же интервале прозрачен кварц, который в УФ спектроскопии применяется как оптический материал для изготовления призм и кювет. Приборы для получения спектров поглощения в этой области просты и доступны. Необходимые для исследования количества вещества невелики - около 0,1 мг. В связи с этим УФ спектроскопия в настоящее время является одним из наиболее распространенных физико-химических методов исследования органических соединений.

Поглощение органическими веществами электромагнитных колебаний в ультрафиолетовой (УФ) и видимой области обусловлено переходом электронов со связывающих орбиталей на разрыхляющие или несвязывающие орбитали; такое состояние молекулы называется возбужденным.

При взаимодействии с квантом света электрон, поглощая энергию, может переходить с высшей заполненной орбитали на низшую вакантную орбиталь. Электроны достаточно прочно удерживаются ядром, поэтому для их возбуждения требуются большие энергии и, следовательно, электромагнитное излучение, имеющее малые длины волн (120 - 800 нм).

Электроны в атомах и молекулах занимают орбитали со строго определенной энергией. Уровень энергии атомных орбиталей определяется соответствующим набором квантовых чисел. Молекулярные орбитали могут рассматриваться как линейные комбинации атомных. Такая комбинация дает связывающую орбиталь (­¯ , электроны с антипараллельными спинами, нормальное состояние) и разрыхляющую орбиталь (­­ , электроны с параллельными спинами, возбужденное состояние).

В обычных органических молекулах присутствуют электроны s - и p -связей, а также электроны неподеленных пар гетероатомов, или n -электроны. Их относительные энергетические уровни и сравнительные энергии возможных переходов в возбужденное состояние представлены на рис. 4, из которого следует, что наибольшая энергия кванта необходима для осуществления перехода s®s* , т.е. для возбуждения электронов наиболее прочной s -связи необходимы кванты света минимальной длины волны. Энергия переходов n®s* и p®p* меньше, и, следовательно, длина волны света, возбуждающего такой переход, соответственно больше. Энергия n -уровня электронов выше энергии p -уровней, поэтому возбуждение вызывается квантами света еще большей длины волны. Практическое значение имеют переходы n ®p* и p®p* , поскольку только им соответствуют длины волн, попадающие в рабочий диапазон прибора. Исключение составляют переходы p®p* изолированных двойных связей С=С и C=N , а также тройных связей и (l макс 160-180 нм). Для изолированных кратных связей в используемом для измерений интервале проявляется только переход карбонильной группы С=О (l макс » 270 нм).

Группировки, вызывающие избирательное поглощение электромагнитного колебания в УФ- области, называются хромофорами . Основными хромофорами, дающими максимум поглощения в области 200-800 нм, являются системы сопряженных двойных связей. Орбитали, образуемые двумя сопряженными двойными связями, представлены на рис. 5.

Из рисунка очевидно, что при взаимодействии двух p - орбиталей, соответствующих изолированным двойным связям, образуются две новые орбитали: связующая (p+p ) и разрыхляющая (p-p ). Возбужденному состоянию также соответствуют две орбитали. Следовательно, для возбуждения электронов сопряженной системы, т.е. для осуществления перехода с высшей заполненной (p-p ) на низшую вакантную (p*+p* ) орбиталь, требуется меньшая энергия, чем для возбуждения электронов изолированных двойных связей (p®p* ), так что сопряженные двойные связи будут поглощать кванты света с большей длиной волны, чем изолированные двойные связи. С ростом числа сопряженных двойных связей энергия, необходимая для возбуждения электронов, будет уменьшаться, и поглощение света будет наблюдаться при больших длинах волн.

Интенсивность поглощения в спектре связана с вероятностью данного типа электронного перехода. Однако далеко не все переходы, формально кажущиеся возможными, осуществляются в действительности. Существуют так называемые правила отбора, определяющие разрешенные и запрещенные переходы. Эти правила учитывают в основном симметрию молекулы, а также электронную симметрию основного и возбужденного состояний; запрещены переходы, при которых происходит изменение спина электрона. Интенсивность поглощения, соответствующего разрешенным переходам, обычно высока, мольный коэффициент погашения достигает тысяч, а иногда и сотен тысяч единиц, тогда как для запрещенных переходов значение e составляет десятки, реже - сотни единиц.

Различные области спектра дают различную информацию. УФ спектры дают важную информацию о наличии кратных и сопряженных связей, ИК спектры позволяют наблюдать многочисленные проявления различных молекулярных группировок, ЯМР- и ЭПР- спектры позволяют исследовать тонкие детали механизмов взаимодействия в реакциях. Поэтому всегда важно использовать различные спектральные методы в комплексе.

Изучение УФ спектров

Электронные уровни наглядно и с высокой точностью описываются в терминах теории молекулярных орбиталей. Исходя из деталей взаимодействия и данных о потенциалах ионизации можно расположить электроны различных молекулярных орбиталей в следующий ряд по их энергии: s. s - орбитали занимают связывающие электроны всех типов органических молекул, p- орбитали заняты электронами двойных и тройных связей, n - орбитали заполняют электроны несвязывающих электронов гетероатомов, например, кислорода или азота. Возбуждение переводит электроны на более высокие разрыхляющие орбитали, энергия которых растет p*. Таким образом, в электронных спектрах могут проявляться следующие переходы: n®p* p®p* (в алкенах, алкинах, карбонильных и азосоединениях); s®p* (в карбонильных соединениях); s®s* (в алканах).

Наличие и интенсивность проявления линии в спектре определяется вероятностью или разрешенностью соответствующего перехода. Для описания спектров используют следующие правила:

а) поглощение одного кванта сопровождается возбуждением одного электрона;

б) суммарное спиновое число при электронном переходе должно остаться неизменным.

Есть правила, учитывающие симметрию молекулы и симметрии основного и возбужденного состояний, но они не столь всеобщи. Во всех устойчивых молекулах электроны всегда спарены, возбуждение переносит электрон на более высокий по энергии уровень, но спин его остается противоположным спину электрона оставшегося. Системы, содержащие только спаренные электроны, называют синглетными ; системы, в которых присутствуют неспаренные электроны - триплетными . Переходы между синглетными или триплетными уровнями разрешены и проявления в спектрах интенсивны (триплетные уровни заселены слабо и соответствующие линии слабы только поэтому), переходы между синглетным и триплетным уровнями, наоборот, запрещены и линии, им соответствующие, малоинтенсивны.

В молекулах можно выделить структурные фрагменты, обуславливающие избирательное поглощение излучение и называемые хромофорами и фрагменты, вступающие в электронное взаимодействие с хромофорами , изменяющие таким образом интенсивность поглощения и/или положение максимума и называемые ауксохромами . Выделяют следующие типы влияния ауксохрома:

а) батохромный сдвиг - смещение полосы поглощения в сторону более длинных волн (меньших частот) или красный сдвиг;

б) гипсохромный сдвиг - смещение в сторону более коротких волн (больших частот) или синий сдвиг;

в) гиперхромный эффект - увеличение интенсивности поглощения;

г) гипохромный эффект - понижение интенсивности поглощения

УФ спектр органического вещества характеристичен, так как поглощение определяется только собственно хромофором и его ближайшим окружением, т. е. один и тот же хромофор проявляется практически одинаково как в относительно простых, так и в самых сложных молекулах. В зависимости от непосредственного окружения одной и той же хромофорной группировки положение максимума поглощения в УФ спектрах различных соединений может несколько изменяться. Сдвиг максимума в сторону более длинных волн принято называть батохромным сдвигом, а сдвиг в сторону более коротких волн - гипсохромным. Замена растворителя в отдельных случаях может вызвать некоторые изменения как в положении полос (на 2- 10 нм), так и в их интенсивности (на 10-20%).

Как правило, такая замена влияет на спектры полярных веществ и практически не сказывается на УФ спектрах неполярных соединений. Наиболее сильные изменения в спектрах обусловлены химическим взаимодействием вещества с растворителем (в частности, образованием водородной связи), а также изменением степени диссоциации или соотношения таутомерных форм вещества. Во всех таких случаях следует проверить, выполняется ли для данного раствора закон Бугера-Ламберта-Бера.

Таким образом, УФ спектроскопия позволяет определить в исследуемых соединениях группировки-хромофоры и дает прекрасную возможность для количественного анализа веществ, содержащих такие группировки. Как структурно-аналитический метод УФ спектроскопия значительно менее информативна по сравнению с другими методами и носит в основном эмпирический характер, поскольку зависимость между характером поглощения и структурой молекулы не имеет строгого физико-математического обоснования, что, однако, не мешает широкому использованию метода.

Отсутствие в УФ спектре исследуемого вещества максимума поглощения в области 200-800 нм служит надежным доказательством того, что в этом веществе не содержатся сопряженные диеновые или полиеновые системы, ароматические ядра и карбонильные группы. Этот признак часто оказывается полезным при установлении структуры соединения, например, позволяет легко различить изомеры с сопряженными и изолированными двойными связями, как в случае приводимой ниже пары:

УФ спектры основных гетероциклических соединений представлены ниже:

Таким образом, достаточно очевидны как преимущества метода (доказательство наличия в исследуемом веществе группировок-хромофоров сопряженной диеновой, полиеновой и ароматической систем, а также карбонильной группы или их отсутствия; в простейших случаях возможность определения типа хромофора, длины цепи сопряжения, числа алкильных групп при хромофоре; количественный анализ, включая регистрацию изменения концентраций растворов во времени), так и ограничения метода (ограниченность рамок применения, так как многие типы органических соединений не имеют максимума поглощения в исследуемой области; сравнительно малые возможности при решении структурно-аналитических задач; в ряде случаев сильное влияние природы растворителя на характер спектра и возможность отклонений от закона Бугера- Ламберта-Бера; фотохимическая изомеризация веществ в процессе работы (например, цис-транс- изомеризация в диеновых и полиеновых системах).